Bahan
1.
Sintesis GVT-0, PGV-0, dan HGV-0
Aseton, siklopentanon,
sikloheksanon, tributilborat, vanilin (p.s. E.Merck); asam asetat glasial, asam
klorida, etanol, etil asetat, heksan, kloroform, metanol (p.a. Merck, Germany), dan akuades.
2. Uji Antikanker in vivo
Alkohol 70%, analog kurkumin
(GVT-0, PGV-0, dan HGV-0) yang disintesis sesuai prosedur (Sardjiman, 2000), akuades,
1,2-dimetilhidrazin.2HCl (ABCR, Germany), formalin 10%, kurkumin (Merck,
Germany), tikus jantan galur Wistar dengan bobot badan 150 – 200 g dan umur 2
bulan, dan phosphate buffered-saline (PBS)
b.
Alat
1. Sintesis, identifikasi, dan uji hasil
sintesis
Alat pemeriksaan titik lebur
(Buchi Melting Point B-540), beker gelas, bunsen, cawan porselin, corong Buchner,
Erlenmeyer, kertas saring (Whatman 40), labu hisap, lempeng kromatografi
lapis tipis (KLT) dengan fase diam GF254, pipet ukur,
spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu A1601), spektrofotometer IR (Perkin Elmer
Spectrum 100), spektrometer massa (Mariner Mass Spectrometer), spektrometer resonansi magnet inti (Varian XL-400),
termopan (Reichert Austria; Nr. 340579), timbangan elektrik (Sartorius).
2. Uji Kemoprevensi in vivo
Alat suntik, eppendorf, kandang hewan, kannula,
timbangan hewan
c.
Jalannya Penelitian
Tahapan penelitian yang akan dikerjakan
adalah : (1) Sintesis GVT-0, PGV-0, dan HGV-0; (2) Uji kemurnian dan
identifikasi hasil sintesis kurkumin, GVT-0, PGV-0, dan HGV-0 dengan elusidasi struktur; (3)
Pengujian kemoprevensi in vivo hasil sintesis GVT-0, PGV-0, dan
HGV-0 dengan model kanker kolorektal pada tikus.
1. Sintesis GVT-0, PGV-0 dan HGV-0 (Sardjiman,
2000)
1.1.
Sintesis GVT-0
Vanilin (38,5 g;0,25 mol),
(27,75 ml;0,38 mol) aseton, 3,5 ml HCl pekat.
Aduk pada suhu -10oC (dalam lemari pendingin) selama 1 jam,
kemudian pada suhu kamar selama 2 jam.
Setelah didiamkan selama 8 hari (warna menjadi coklat), campuran
tersebut dicuci dengan air:etanol (1:0,57) sampai terbentuk warna jingga. Campuran dicuci dengan air dingin sampai
bebas asam lalu dikeringkan.
1.2.
Sintesis PGV-0
Vanilin (15,4 g; 0,1 mol)
dalam Erlenmeyer ditambah siklopentanon (4,4 ml; 0,05 mol) diaduk sampai
homogen pada suhu 25 – 30 oC. Ditambahkan 2,0 ml HCl pekat
bertetes-tetes, kemudian pengadukan dilanjutkan selama 1 jam (sampai
memadat). Hasil didiamkan selama 2 hari
pada suhu kamar, kemudian diisolasi dengan maserasi campuran asam asetat glasial – air (1:1), kemudian
disaring dengan cepat dalam keadaan dingin dan dilanjutkan dengan campuran asam
asetat glasial – air sampai warna hijau tua hilang. Dicuci dengan air panas sampai bebas asam dan
dikeringkan.
1.3.
Sintesis HGV-0
Vanilin (15,4 g; 0,1 mol)
dalam Erlenmeyer ditambah sikloheksanon (4,4 ml; 0,05 mol) diaduk sampai
homogen pada suhu 25 – 30 oC. Ditambahkan 2,0 ml HCl pekat
bertetes-tetes, kemudian pengadukan dilanjutkan selama 1 jam (sampai
memadat). Hasil didiamkan selama 2 hari
pada suhu kamar, kemudian diisolasi dengan maserasi campuran asam asetat glasial – air (1:1), kemudian disaring
dengan cepat dalam keadaan dingin dan dilanjutkan dengan campuran asam asetat
glasial – air sampai warna hitam kemerahan hilang. Dicuci dengan air panas sampai bebas asam dan
dikeringkan.
2. Uji
kemurnian dan identifikasi hasil sintesis GVT-0, PGV-0, dan HGV-0
2.1. Pengujian kemurnian dengan penentuan jarak
lebur
Senyawa hasil sintesis dan
hasil pemurnian diuji jarak leburnya dengan alat Buchi Melting Point B-540.
2.2.
Pengujian kemurnian dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Senyawa dilarutkan dalam
metanol, kemudian ditotolkan sebanyak 2 ml pada lempeng silica gel GF254
dari aluminium, dengan fase gerak campuran heksan, kloroform, etil asetat, dan
metanol dengan perbandingan bervariasi untuk menghasilkan pemisahan yang
sempurna. Spot kromatogram diamati pada
UV 254 dan 366 nm.
2.3.
Elusidasi Struktur
Elusidasi struktur dilakukan
menggunakan spektrofotometer UV-VIS, spektrofotometer inframerah, spektroskopi
massa, dan spektrometer NMR yang analisis hasilnya digunakan untuk
menginterpretasikan rumus struktur dari senyawa hasil sintesis.
3.
Uji kemoprevensi kolorektal
3.1. Penimbangan Bobot Badan pada Hewan Coba
Tikus Wistar ditimbang 1 kali dalam
seminggu dan dilakukan selama 2 minggu pada tahap adaptasi hewan. Selanjutnya penimbangan berat badan hewan coba dilakukan sehari sebelum dilakukan
induksi untuk menghitung jumlah dosis yang akan digunakan. Keesokan harinya, hewan coba ditimbang lagi
lalu diinduksi.
3.2. Induksi Kanker Kolorektal
Tikus Wistar yang telah diadaptasikan selama 1
minggu, bobot badannya ditimbang sehari sebelum induksi dengan
1,2-dimetilhidrazin.2HCl sebanyak 1 ml. Penginduksian
dilakukan sebanyak 1 kali seminggu secara injeksi subkutan (s.c) selama 15
minggu. Setelah diinduksi selama 15
minggu, tikus dibiarkan selama 10 minggu lalu dibedah dan diamati kanker yang
terjadi (Ravnik-Glavac et al., 2000).
3.3. Pengamatan Morfologi
Saat
otopsi, semua organ dalam diperiksa kecuali sistem saraf pusat. Perhatian khusus kemungkinan adanya tumor
pada saluran pendengaran bagian luar.
Bagian perut dibuka melalui lengkungan utama sedangkan usus secara
longitudinal pada sisi antimesenterial; setelah dibuka, organ-organ tersebut
dicuci dengan air. Bagian akhir ileum,
usus besar, anus dan neoplasma dalam usus kecil disebar di atas papan
polystirene dengan mukosa usus menghadap ke atas. Semua jaringan disimpan dalam buffer formalin
10%. Seluruh lesi pada usus dinilai
berdasarkan kriteria makroskopik dan histologis yang digunakan pada patologi
manusia (Ravnik-Glavac
et al., 2000).
3.4. Pewarnaan untuk Ekspresi Protein p53, K-ras,
APC, dan COX-2
Empat mm bagian blok parafin
dipotong. Bagian yang tidak berparafin,
diteteskan larutan H2O2 3% dalam metanol untuk memblokir
aktivitas peroksidase endogen. Teteskan
antibodi monoklonal primer untuk protein yang ingin diamati, diinkubasi selama
30 menit pada suhu kamar. Kompleks
antigen-antibodi divisualisasikan menggunakan teknik pewarnaan
biotin-streptavidinperoksidase. Warna
dikembangkan dengan larutan diaminobenzidin (DAB) dan ditambahkan
hematoxylin. Slide kemudian dikeringkan
dan diamati di bawah mikroskop (Ghavam-Nasiri et al., 2007).
.
3.5. Perlakuan dengan Senyawa Kurkumin dan Analognya
Tikus
Wistar (130 ekor) dibagi dalam 5 kelompok.
Kelompok 1 (kontrol positif) yang diberikan injeksi DMH.2HCl. Kelompok 2, 3, 4, dan 5 dilakukan hal yang sama dengan kelompok 1
dengan pemberian senyawa kurkumin dan analognya (GVT-0, PGV-0, dan HGV-0)
sebanyak 20, 40, 60
mg/kg bobot badan
yang dibuat suspensi dengan Na CMC 0,5% diberikan per oral dan dibuat segar setiap perlakuan. Kelompok
5 (kontrol negatif) yang diinjeksi subkutan (s.c) dengan larutan
fisiologis 1 ml. Tikus pada kelompok 1
dan 5diberikan akuades secara per oral.
Bobot badan seluruh hewan ditimbang satu kali seminggu sampai akhir
pemberian injeksi DMH, dan setiap minggu
sampai akhir perlakuan pada minggu ke-5.
Hewan dibedah pada minggu ke-25.
Kolon dikeluarkan dan dibuka secara longitudinal, dibersihkan dengan
PBS, dimasukkan dalam formalin 10%, dikeringkan dan ditanam dalam parafin,
bagian dengan ketebalan 5 mm diproses untuk
analisis histopatologi.
Skema/alur
kerja pada penelitian ini dapat dilihat pada gambar 10.
d. Analisis Data
·
Hasil penelitian in vivo meliputi
jumlah nodul, area (diameter PxL) dianalisis secara non-parametrik.
·
Derajat kerusakan jaringan dianalisis secara deskriptif
·
Ekspresi protein yang berkaitan dengan progresi/pertumbuhan kanker
kolorektal dianalisis dengan one way ANOVA diikuti dengan Poshoc Test (Tukey Test)
·
Berat badan analisisnya dengan multi factor random design (Split Splot)
